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荧光团与光学滤光片在荧光显微中的应用

荧光显微技术是一种利用荧光团诱发荧光的显微技术，与吸收、散射或反射不同。荧光团（或荧光色素）是一种荧光染料，用于在蛋白质、组织和细胞上标记标签，以便通过荧光显微镜进行检查。荧光团的工作原理是吸收特定波长的能量（通常称为激发范围），并在另一特定波长区域（称为发射范围）重新发射该能量。荧光显微系统（如外荧光显微镜）可以很简单，而共焦或多光子系统则可能非常复杂。不过，所有荧光显微镜都有相同的基本概念：激发能量照亮样品，样品释放出微弱但可量化的发射能量。激发和发射波长的中心波长并不相同。这就需要专门的滤光片来增加整体对比度和信号。图 1：典型的荧光显微镜装置最基本的概念和示意图见图 1。滤光片排列由三种类型的滤光片组成：激发滤光片、分色滤光片和发射滤光片。 滤光片1：激发滤光片激发滤光片置于荧光显微镜的照明路径中，可滤除除荧光团激发范围以外的所有光源波长。滤光片的最小透射率决定了图像的亮度和光彩。建议任何激发滤光片的透射率至少为 40%，理想情况下透射率大于 85%。激发滤光片的带宽应完全在荧光团的激发范围内，使滤光片的中心波长（CWL）尽可能接近荧光团的峰值激发波长。激发滤光片的光密度（OD）决定了背景图像的暗度；OD 是衡量滤光片阻挡透射范围或带宽以外波长的程度。建议最低光密度为 3.0，但理想的光密度为 6.0 或更高。滤光片2：二向色滤光片或分光镜二向色滤光片以 45° 角放置在激发滤光片和发射滤光片之间，将激发信号反射到荧光团，同时将发射信号透射到检测器。理想的二向色滤光片和分光器在最大反射和最大透射之间有鲜明的过渡，在激发滤光片的带宽内反射率大于 95%，在发射滤光片的带宽内透射率大于 90%。选择滤光片时应考虑荧光团的交叉波长 (λ)，以尽量减少杂散光，最大限度地提高荧光图像的信噪比。滤光片3：发射滤光片发射滤光片置于荧光显微镜的成像路径内，滤除荧光团的激发范围，同时透射发射范围。对激发滤光片的建议同样适用于发射滤光片：最小透射率、带宽、外径和中心波长（CWL）。具有理想的 CWL、最小透射率和 OD 组合的发射滤光片可提供最亮的图像，同时具有最深的遮挡，并能确保检测到最微弱的发射信号。图 2：通用荧光团光谱曲线图 2 显示了典型的激发和发射曲线。吸收和发射曲线具有共同的波长，这也是为什么需要具有高透射率、窄带宽、高外径以及锐利的导通和截止带的高质量滤光片的原因之一。使用劣质滤光片最终会损坏样品、试样或昂贵的传感器。请联系我们，我们将帮助您选择适合您应用的滤光片。Edmund Optics如何实现滤光片配对？Edmund Optics提供数十种现货供应的光学滤光片，可匹配指定荧光团的激发和发射光谱区域，并支持快速发货‌。用户可通过荧光团特性直接搜索匹配滤光片，系统会根据峰值激发或发射波长推荐对应产品，确保该波长处实现最大透射率‌。
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